ABSTRACT
The objective of the study was to evaluate the effect of time of gestation on fatty acid transporter mRNA expression in maternal and fetal bovine placenta. Placentas from twelve cows at different thirds of gestation (n=4 per third) were sampled at slaughter to measure FATP-1, FATP-4, FABP-1 mRNA concentration in maternal (caruncles) and fetal (cotyledons) side. Once the placenta was removed, 1cm2 was dissected and, divided into caruncles and cotyledons, stored in sterile tubes, dropped into liquid nitrogen and kept at -80° C until rtPCR analysis. Data were analyzed as a complete randomized design with a 3 x 2 factorial arrangement, using the mixed procedure (SAS 9.3) with repeated measurements on space. Time of gestation, side of the placenta and their interaction were fixed factors, whereas animal was a random factor. There was a time by treatment interaction (P < 0.01) on FATP-1 mRNA expression due to a greater mRNA expression in cotyledons on the first third of gestation as compared with the concentration in caruncles. On the second and third stages of gestation, the mRNA concentration in cotyledons decreased, reaching a similar concentration to that observed in caruncles. Fatty acid transport protein -4 and FABP-1 mRNA concentration were not different (P >0.1). We conclude that FATP-1 might play an important role in fatty acid transport during early fetal development.
O objetivo do estudo foi avaliar o efeito do tempo de gestação na expressão de mRNA de transportador de ácidos graxos em placenta bovina materna e fetal. Foram colhidas amostras de placentas de 12 vacas em diferentes terços da gestação (n = 4 por terço) no abatedouro para medir a expressão de mRNA de FATP-1, FATP-4, FABP-1 no lado materno (carúnculos) e fetal (cotilédones). Uma vez que a placenta foi removida, 1 cm2 foi dissecado e, dividido em carúnculos e cotilédones, armazenado em tubos estéreis, caiu em nitrogenio líquido e mantido a -80 ° C até a análise rtPCR. Os dados foram analisados como um delineamento inteiramente casualizado com esquema fatorial 3 x 2, utilizando o procedimento misto (SAS 9.3) com medidas repetidas no espaço. O tempo de gestação, o lado da placenta e sua interação foram fatores fixos, enquanto que o animal foi um fator aleatório. Houve um tempo de interação do tratamento (P <0,01) na expressão de mRNA de FATP-1 devido a uma maior expressão de mRNA em cotilédones no primeiro terço da gestação em comparação com a concentração em carúnculas. No segundo e terceiro terços da gestação, a expressão de mRNA nos cotilédones diminuiu, atingindo uma expressão semelhante à observada em carúnculas. A proteína de transporte de ácidos graxos 4 e a expressão de mRNA de FABP-1 não foram diferentes (P> 0,1). Concluímos que a FATP-1 poderia desempenhar um papel importante no transporte de ácidos graxos durante o desenvolvimento fetal precoce.
Subject(s)
Placenta , Pregnancy , RNA, Messenger , Cattle , Fatty AcidsABSTRACT
La policitemia vera (PV), la trombocitemia esencial (TE) y la mielofibrosis idiopática (MI) constituyen las Neoplasias Mieloproliferativas cromosoma Filadelfia negativas (NMP Ph-neg). La mutación V617F en el exón 14 del gen JAK2 ha sido descripta en un 90% de los casos de PV y en un 50% de TE y MI. Recientemente, se identificaron mutaciones en el exón 10 del gen MPL y en el exón 9 del gen CALR, presentes en un 5 y 73% de pacientes con TE y MI sin mutaciones en JAK2, respectivamente. En el presente trabajo se estudió la detección de dichas mutaciones en 52 pacientes con NMP, mediante amplificaciones por PCR en Tiempo Real con posterior análisis por High Resolution Melting (HRM) y secuenciación. La mutación V617F en JAK2 fue registrada en un 83,3% de pacientes con PV y 42,8% con TE y MI. Un 6,25% y 56,25% de pacientes con TE y MI JAK2 negativos resultaron positivos para mutaciones en el exón 10 de gen del receptor de la trombopoyetina (MPL) y el exón 9 de gen de la calreticulina (CALR). El análisis por HRM puede ser considerado como herramienta diagnóstica eficaz para las NMP debido a su alta sensibilidad, bajo costo y tiempo de procesado, teniendo en cuenta el impacto clínico que podría tener en los pacientes la detección temprana de dichas mutaciones.
Polycythemia vera (PV), essential thrombocythemia (TE) and idiopathic myelofibrosis (MI) are Philadelphia chromosome-negative myeloproliferative neoplasms (MPN-Ph. Neg). The presence of the V617F mutation in exon 14 of the JAK2 gene has been described in 90% of cases of PV and 50% of MI and TE. Recently, mutations in exon 10 of the MPL gene and exon 9 of CALR gene have been identified, which are present in 5 to 73% of patients with TE and MI without mutations in JAK2, respectively. In this work, the detection of these mutations was studied in 52 patients with NMP, using real time PCR amplifications with subsequent High Resolution Melting (HRM) analysis and sequencing. A total of 83.3% of patients with PV and 42.8% with MI and TE were recorded as positive for the V617F mutation in JAK2. A total of 6.25% and 56.25% of the patients with MI and TE with non-mutated JAK2 were positive for mutations in MPL exon 10 and CALR exon 9. HRM analysis could be considered an effective diagnostic tool for NMP due to its high sensitivity, low cost and processing time, taking into account the clinical impact that early detection of such mutations could have on patients.
Policitemia vera (PV), trombocitemia essencial (TE) e mielofibrose idiopática (MI) constituem as Neoplasias Mieloproliferativas cromossomo Filadélfia negativas (NMP Ph-neg). A mutação V617F no exon 14 do gene JAK2 foi descrita em 90% dos casos de PV e em 50% de TE e MI. Recentemente, foram identificadas mutações no exon 10 do gene MPL e no exon 9 do gene CALR, presentes em 5 a 73% de pacientes com TE e MI sem mutações em JAK2, respectivamente. Neste trabalho foi estudada a detecção de tais mutações em 52 pacientes com NMP, usando amplificações por PCR em Tempo Real, com posterior análise por High Resolution Melting (HRM) e sequenciamento. 83,3% dos pacientes com PV e 42,8% com TE e MI foram positivos para a mutação V617F em JAK2. 6,25% e 56,25% de pacientes com TE e MI JAK2 negativo foram positivos para mutações no exon 10 de gene do receptor da trombopoietina (MPL) e o exon 9 de gene da calreticulina (CALR). A análise por HRM pode ser considerada como ferramenta de diagnóstico eficaz para as NMP, devido à sua alta sensibilidade, baixo custo e tempo de processamento, tendo em conta o impacto clínico que poderia ter a detecção precoce de tais mutações nos pacientes.
Subject(s)
Clinical Laboratory Techniques , Diagnosis , Neoplasms/blood , Myelodysplastic-Myeloproliferative Diseases/diagnosis , Molecular BiologyABSTRACT
El análisis de ADN fetal libre en plasma ,materno permite estudiar material genético del feto sin realizar procedimientos invasivos sobre el embarazo. La identificación del sexo fetal mediante la detección de ADN del cromosoma masculino Y, en el plasma de mujeres embarazadas, es de gran utilidad en embarazos con riesgos para hiperplasia suprarrenal congénita o para enfermedades ligadas al cromosoma X. El presente estudio tuvo objetivo evaluar la factibilidad y desempeño diagnostico de la determinación del sexo fetal a través del análisis por PCR en tiempo real de ADN fetal libre en plasma de embarazadas . Se extrajeron 10 mL de sangre periférica a 134 pacientes embrazadas entre las 5 y 32 semanas de gestación, se separó el plasma y se efectuó extracción de ADN. Las muestras se analizaron mediante PCR en tiempo real amplificando el marcador DYS 14 presente en el cromosoma Y. El sexo fetal se confirmo mediante ecografia realizada entre las semanas 20 y 32. la sensibilidad y especificidad de la técnica para detectar el sexo fetal fue 98.5%y del 80,7% respectivamente. La menor edad gestacional de diagnóstico fue 5 semanas. La técnica implementada ha mostrado un desempeño diagnostico similar al descrito en la bibliografía...
Subject(s)
Humans , Diagnosis , Fetus , Sex , DNA , Ultrasonography , Diagnosis , Pregnancy , PlasmaABSTRACT
La Policitemia Vera (PV), la Trombocitemia Esencial (TE) y la Mielofibrosis Primaria (MP) son neoplasias mieloproliferativas caracterizadas por una proliferación excesiva de una o más líneas mieloides. En el año 2005 se identificó una mutación somática en el gen Janus kinase 2 (JAK2), que resulta en el reemplazo en la proteína de una fenilalanina por una valina en la posición 617 (JAK2 V617F). Esta mutación se encuentra en el 95% de pacientes con PV, y en la mitad de los casos de TE o MP. Se han descripto metodologías que permiten identificar esta mutación: dentro de las más utilizadas se encuentran la ARMS PCR (del inglés Amplification Refractory Mutation System PCR), la secuenciación y recientemente la HRM (High Resolution Melting). En este trabajo se estudió la detección de JAK2 V617F en muestras de pacientes con desórdenes mieloproliferativos mediante HRM, determinando especificidad y sensibilidad de la misma, comparándola con la ARMS PCR y la secuenciación. Los resultados demostraron que la técnica de HRM es superior a la secuenciación y equivalente a la ARMS PCR. Las metodologías sensibles y específicas para la detección de JAK2 V617F, en pacientes con neoplasias mieloproliferativas, son de gran importancia a nivel diagnóstico ya que permiten diferenciar entre desórdenes neoplásicos y condiciones reactivas.
Polycythemia Vera (PV), Essential Thrombocythemia (TE) and Primary Myelofibrosis (MP) are myeloproliferative neoplasias characterized by excessive proliferation of one or more myeloid lines. In 2005, a somatic mutation was identified in the Janus kinase 2 gene (JAK2), resulting in the replacement of a phenylalanine in the protein for a valine at position 617 (JAK2 V617F). This mutation was found in 95% of patients with PV, and in half of the cases of TE or MP. Different methodologies have been described to identify this mutation: the most used are ARMS PCR (Amplification Refractory Mutation System PCR), sequencing and recently HRM (High Resolution Melting). In this work, detection of JAK2 V617F was studied in samples from patients with myeloproliferative disorders using HRM, determining its specificity and sensitivity in comparison with ARMS PCR and sequencing. The results showed that the technique is superior to sequencing and equivalent to ARMS PCR. Sensitive and specific methodologies for the detection of JAK2 V617F in patients with myeloproliferative neoplasias are of great importance at diagnostic level since they can differentiate between neoplastic disorders and reactive conditions.
Policitemia Vera (PV), Trombocitemia Essencial (TE) e Mielofibrose Primária (MP) são neoplasias mieloproliferativas caracterizadas por uma proliferação excessiva de uma ou mais linhas mieloides. Em 2005, uma mutação somática foi identificada no gene Janus quinase 2 (JAK2), resultando na substituição na proteína de uma fenilalanina para uma valina na posição 617 (JAK2 V617F). Esta mutação é encontrada em 95% dos pacientes com policitemia vera, e na metade dos casos de TE ou MP. Foram descritas metodologias para identificar esta mutação: dentre as mais utilizadas estão ARMS PCR (Amplification Refractory Mutation System PCR), sequenciamento e, recentemente, HRM (High Resolution Melting). Neste trabalho a detecção de JAK2 V617F foi estudada em amostras de pacientes com neoplasias mieloproliferativas usando HRM, determinando a sensibilidade e especificidade da mesma, comparando-a com a ARMS PCR e o sequenciamento. Os resultados mostraram que a técnica de HRM é superior ao sequenciamento e equivalente à ARMS PCR. Sensíveis e específicas para a detecção de JAK2 V617F em pacientes com neoplasias mieloproliferativas, as metodologias são de grande importância em nível de diagnóstico, uma vez que permitem diferenciar entre doenças neoplásicas e condições reativas.